Частные уроки по физике

Материалы и методы пассирования культур
Образовательная информация

Были использованы монослойные культуры цельных эмбрионов крыс, выращиваемые по общепринятой методике. Использовались среды № 199, Игла, гидролизат лактальбумина с добавлением 10% (для первичных) и 20% (для пассажных культур) бычьей сыворотки.

Для длительного пассирования культур с последующей подсадкой к ним клеток саркомы Рауса применялись другие варианты питательных сред, о чем будет сказано ниже.

В качестве источника вируса использовали гомогенаты замороженной или свежей опухоли штамм Карра. Гомогенаты приготовляли на растворе Эрла в разведении 1 : 20 при титре вируса в опухоли 1 : 10*. Гомогенаты осветлялись центрифугированием в течение 30 минут при 400 g. Культуры после 1-го пассажа заражали штаммом Карра в клеточной суспензии или наслаиванием вируссодержащей суспензии на растущий монослой при следующих условиях:

1) после выдерживания культур при комнатной температуре в течение 24 часов; 2) после облучения культур в дозе 300, 600 и 900 г; 3) после длительного пассирования; 4) к некоторым зараженным и незараженным культурам подсаживали суспензию клеток саркомы Рауса штаммы Карра и Энгельбрет-Холма в соотношении 2 хЮ клеток саркомы на 5—10 клеток крысиной культуры.

отравление угарным газом

Зараженные культуры исследовали на присутствие инфек-циозного вируса в разные сроки внутримышечной прививкой культуральной жидкости и разрушенных замораживанием и оттаиванием клеток 2—5-дневным цыплятам внутримышечно.

Наличие вирусного антигена контролировалось при помощи метода флуоресцирующих антител по Кунсу. Методика приготовления меченых сывороток против саркомы Рауса описана нами ранее.

Кроме обычных при этом методе контролей — окраски нормальных культур иммунной меченой сывороткой и окраски зараженных культур нормальной меченой сывороткой — в ряде случаев проводили истощение меченой сыворотки концентрированным вирусом Рауса. Вирус осаждался на ультрацентрифуге Spinco из культуральной жидкости растущей в монослое куриной саркомы Рауса. Истощенной сывороткой обрабатывали зараженные вирусом Рауса препараты. Свечение в клетках полностью исчезало, за исключением незначительной флуоресценции ядерных структур.

Кроме того, наличие вирусного антигена на поздних стадиях культивирования было исследовано следующим образом. Кроликов подвергали иммунизации живыми клетками зараженных культур по китайскому методу в конъюнктиву. Было проведено три цикла иммунизации; каждый состоял из 3 инъекций. В первом цикле каждому кролику вводили по 20 млн. клеток на инъекцию, во втором и третьем циклах — по 40 млн. клеток. По окончании иммунизации сыворотки кроликов испытывали на присутствие вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации вируса Рауса на курах.

Морфологические изменения в культурах изучали на препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, и на живых растущих культурах. Изменения белкового обмена в клетках исследовали при помощи метода окраски на РНК пиронином по Бра-ше и акридиноранжем по Берталланфи и Биккису.

В зараженных культурах исследовали наличие блокирующих вирус веществ: суспензию клеток, зараженных за 25—26

дней вирусом, смешивали в равных объемах с разными разведениями вирусной суспензии — от 1 : 10 до 4x1 : 10. На каждое разведение вируса приходилось по 8 x10е клеток. После инкубации в течение 40 минут при 37° смеси титровали на курах.

Клетки культур, претерпевших морфологические изменения, вводили под кожу новорожденным крысятам Wistar. Параллельно с этим часть таких культур подвергали замораживанию и оттаиванию и вместе с культуральной жидкостью вводили цыплятам. В некоторых сериях опытов зараженные культуры перед введением их цыплятам подвергали ультрафиолетовому и рентгеновскому облучению с целью активизации вируса. Всего таким образом было изучено 6 серий крысиных культур. Срок наблюдения за культурами составлял от 20 часов до 4/2 месяцев.

Медицинские советы М.Струбциновой





Спонсор публикации: